產(chǎn)品概述

        2×SYBR Green PCR Master Mix 是采用 SYBR Green I 嵌合熒光法進(jìn)行 Real Time PCR 的專用試劑。含有常溫下完全封閉 Taq 酶活性的熱啟動酶 HS Taq DNA Polymerase,能夠有效抑制低溫條件下引物非特異性退火或者引物二聚體引起的非特異性擴(kuò)增，提高擴(kuò)增反應(yīng)的特異性。本試劑經(jīng)過特殊配制，采用優(yōu)化配方的qPCR 專用 Buffer，大大提高了 qPCR 反應(yīng)的擴(kuò)增效率和檢測靈敏度，可以在較寬的定量區(qū)域內(nèi)得到良好的標(biāo)準(zhǔn)曲線，準(zhǔn)確進(jìn)行定量。本試劑與多數(shù)廠家的熒光定量 PCR 儀兼容，如 Applied Biosystems、Eppendorf、Bio-Rad 和Roche 等。

儲存條件：

     本產(chǎn)品-20℃保存有效期至少一年，4℃可保存3個月。解凍后應(yīng)充分混勻，避免產(chǎn)生大量氣泡。

試劑原理：

     本產(chǎn)品利用熱啟動酶 HS Taq DNA polymerase 進(jìn)行 qPCR 擴(kuò)增反應(yīng)，通過擴(kuò)增產(chǎn)物嵌合SYBR Green I 而激發(fā)的熒光信號強度進(jìn)行檢測。
1、 PCR
     PCR 法是以微量 DNA 進(jìn)行目的片段擴(kuò)增的方法。通過 DNA 鏈的熱變性、引物退火、DNA  聚合酶作用下引物的延伸三個步驟循環(huán)往復(fù)，可在短時間內(nèi)擴(kuò)增大量 DNA  片段。
2、 熒光檢出
     SYBR Green I 是一種結(jié)合與小溝中的雙鏈DNA 結(jié)合染料，與雙鏈 DNA 結(jié)合后，其熒光大大增強，最大吸收波長約為 497nm，發(fā)射波長最大約為 520nm。
     SYBR Green I 可以與所有的雙鏈 DNA 相結(jié)合，無需使用探針，即可實現(xiàn)檢測，通用性好，且靈敏度很高。但是，由于 SYBR Green I 與所有的雙鏈 DNA 相結(jié)合，因此由引物二聚體、單鏈二級結(jié)構(gòu)以及錯誤的擴(kuò)增產(chǎn)物引起的假陽性會影響定量的精確性。在定量儀器檢測過程中，可以通過測量升高溫度后熒光的變化，由解鏈曲線來分析產(chǎn)物的均一性，從而區(qū)分產(chǎn)物的熔解峰溫度而區(qū)分特異與非特異的產(chǎn)物。

使用方法：

反應(yīng)條件
1、 兩步法 
熱啟動：95℃ 10  分鐘；
變 性：95℃ 10～20 秒；
退火/延伸：60℃ 20～60 秒。   35--45個循環(huán)
熔解曲線分析。
    
2、 三步法
熱啟動：95℃ 10  分鐘；
變 性：95℃ 10～20 秒；
退 火：56-64℃ 10～30 秒；
延  伸：72℃  10～60  秒。     35--45個循環(huán)
熔解曲線分析。
對于 Roche LightCycler480，熱啟動時間應(yīng)采用 10min，ABI7500 也可以采用 5min 熱啟動。

SYBR Green PCR Master Mix 生產(chǎn)和測試：

質(zhì)量評估指標(biāo)：

1、Cq值相比主流品牌差異；

2、NTC有無非特異性擴(kuò)增；

3、擴(kuò)增效率相比主流品牌差異；

4、模板在低拷貝極限下，特異性擴(kuò)增相比主流品牌差異；

5、平臺期的熒光值相比主流品牌差異；

6、批次之間擴(kuò)增曲線、溶解曲線重復(fù)性情況；

7、模擬運輸環(huán)境測試，產(chǎn)品性能重復(fù)性情況。

進(jìn)行人源β-actin擴(kuò)增

以人源的CDNA原液進(jìn)行8倍梯度稀釋，稀釋9個點進(jìn)行擴(kuò)增。