鑒定：支原體是一類缺乏細(xì)胞壁的細(xì)胞，呈高度多形性，細(xì)胞培養(yǎng)中被支原體污染是比較常見的問題，因?yàn)槲廴緛碓刺?，包括工作環(huán)境、操作者、血清、實(shí)驗(yàn)器材等，鑒定的方法如下。
1. 相差顯微鏡觀察。其中可以采用直接觀察或地衣紅染色觀察，直接觀察時(shí)，位于細(xì)胞表面和細(xì)胞之間的暗色微小顆粒為支原體，但要與線粒體區(qū)分。
2. 熒光染色法。將細(xì)胞接種于蓋玻片上，在細(xì)胞未長(zhǎng)滿前取出玻片，用不含酚紅的Hank's液漂洗后，再用1:3醋酸甲醇固定10min，然后用生理鹽水漂洗，置于用生理鹽水配制的 Hoechst 33258(濃度為50ul/ml)中染色10min，熒光染料將支原體內(nèi)的DNA著色，染色后用蒸餾水洗1~2min，滴加pH5.5磷酸緩沖液數(shù)滴，然后置熒光顯微鏡下觀察。鏡下散于細(xì)胞周圍或附于細(xì)胞膜表面的亮綠色小點(diǎn)為支原體。
3. 電鏡檢查。制備電鏡標(biāo)本，用掃描電鏡或透射電鏡觀察。
4. DNA分子雜交檢查。按試劑盒說明進(jìn)行，檢出率高，但方法較復(fù)雜。
5. PCR?，F(xiàn)有支原體PCR檢測(cè)試劑盒銷售，可按說明書檢測(cè)支原體污染。
上：支原體污染細(xì)胞熒光圖
下：無污染細(xì)胞熒光圖
圖片來源：互聯(lián)網(wǎng)
預(yù)防：支原體污染屬于微生物污染，預(yù)防手段與真菌污染相近，在此基礎(chǔ)上，可用100微克每毫升的卡那霉素抑制支原體，但可能對(duì)細(xì)胞有所損傷，盡量不加抗生素。
污染去除：
1. 抗生素處理:。用100微克每毫升卡那霉素清除培養(yǎng)物中的支原體污染。亦有將細(xì)胞培養(yǎng)瓶直放,瓶?jī)?nèi)裝人含600ug/ml 卡那霉素的生長(zhǎng)液至瓶頸部,37C孵育 18h,然后移人含200ug/ml卡那霉素的生長(zhǎng)液，可成功處理支原體。金霉素對(duì)細(xì)胞毒性較卡那霉素大，常用濃度為100~200ug/ml。對(duì)卡那霉素、四環(huán)素有抗藥性的支原體可用泰樂菌素處理，對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞無不良影響，污染細(xì)胞以50ug/ml泰樂菌素處理6天，或連續(xù)處理2代，可長(zhǎng)期有效地清除支原體污染。
2. 高熱處理。因支原體和細(xì)胞對(duì)熱的耐受性不同，將受污染的細(xì)胞41℃作用5~10h，最長(zhǎng)達(dá)18h，可以破壞支原體，而細(xì)胞僅少許損傷,即可恢復(fù)。對(duì)溫度敏感的細(xì)胞株不能采用這種方法。
3. 巨噬細(xì)胞和抗生素聯(lián)合處理。將同種動(dòng)物腹腔巨噬細(xì)胞加入被支原體污染的細(xì)胞中(巨噬細(xì)胞與污染細(xì)胞比例為100:1)，再加入100ug/ml的抗生素，結(jié)合支持物方法培養(yǎng)逐日檢查，直至支原體被巨噬細(xì)胞消除。
4. 鼠的傳代培養(yǎng)。如果還是無法消除污染，該細(xì)胞為高價(jià)值的腫瘤細(xì)胞，則可以將腫瘤細(xì)胞接種與BALB/c裸鼠的頸背部（每只接種4×106細(xì)胞），接種3-5只，一個(gè)月后取瘤塊進(jìn)行原代培養(yǎng)。
5. 血清處理。將污染的細(xì)胞接種于含 10% 非滅活血清培養(yǎng)基中，孵育 6h后，去除了包括人-人雜交瘤在內(nèi)的5種細(xì)胞系中污染的支原體，其中起作用的是補(bǔ)體成分。
6. 支原體去除試劑。用MRA處理細(xì)胞，每4天換一次液，連續(xù)處理15天。也有網(wǎng)友推薦MycoplasmaOUT™ Treatment試劑，用一天后，細(xì)胞恢復(fù)生長(zhǎng)。
有關(guān)病毒污染的資料不多，但一般認(rèn)為病毒污染不影響細(xì)胞培養(yǎng)，通過PCR技術(shù)可以檢測(cè)。不過病毒污染對(duì)生產(chǎn)疫苗是不安全的。因此，至今，潛在病毒是細(xì)胞大量生產(chǎn)和疫苗、干擾素等生物制品制作的難題。有研究顯示用伽馬射線可清除牛血清的大部分病毒，現(xiàn)如今最值得期待的是下游工藝中除病毒過濾器的開發(fā)。
鑒定：
1. 形態(tài)學(xué)鑒定。形態(tài)觀察是辨認(rèn)細(xì)胞最簡(jiǎn)單和最直接的方法，但我們也應(yīng)意識(shí)到它有
一定的不足，因?yàn)槠渲卸鄶?shù)細(xì)胞形態(tài)與不同培養(yǎng)環(huán)境對(duì)細(xì)胞形態(tài)的可塑性有關(guān)。例如,在單層匯合狀態(tài)心部位生長(zhǎng)的上皮細(xì)胞，一般形態(tài)規(guī)則，呈多角形，而且邊緣清晰明確，而生長(zhǎng)在小片邊緣同樣的細(xì)胞，形態(tài)就不規(guī)則，呈伸開狀；如果發(fā)生轉(zhuǎn)化，就會(huì)從小片上脫離，變?yōu)槌衫w維細(xì)胞樣的形態(tài)。
2. 種屬鑒定。染色體分析是區(qū)分物種的最佳方法。 同工酶電泳也是一種較好的診斷
檢測(cè)方法，而且比染色體分析快，但需要合適的儀器和試劑。
3. 譜系或組織標(biāo)記。如細(xì)胞表面抗原、中間纖維蛋白、酶類、分化產(chǎn)物，根據(jù)以上物
質(zhì)的差異，運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)等技術(shù)，鑒定是否發(fā)生細(xì)胞交叉污染。
4. STR分型。
預(yù)防：1. 實(shí)驗(yàn)器材如吸管不能混用。幾種細(xì)胞同時(shí)實(shí)驗(yàn)時(shí),器材要做好專用標(biāo)記。
2. 細(xì)胞培養(yǎng)液公用時(shí)，細(xì)胞吸管和細(xì)胞用液要分開，千萬不能用細(xì)胞吸管直接吸取細(xì)胞培養(yǎng)液。吸取培養(yǎng)液的吸管尖端不要觸及培養(yǎng)瓶瓶口，避免把細(xì)胞帶到培養(yǎng)液瓶中，防止進(jìn)行其他細(xì)胞培養(yǎng)操作時(shí)導(dǎo)致細(xì)胞污染。
3. 所有轉(zhuǎn)來的細(xì)胞或自己所建的細(xì)胞系都要在早期留有充足的凍存樣本備用，一旦發(fā)生細(xì)胞交叉污染，可以復(fù)蘇早期凍存細(xì)胞來使用。
去除方法：解決細(xì)胞交叉污染的問題最好的方法就是進(jìn)行單克隆化，前提是要保證原細(xì)胞株還存在。具體是通過有限稀釋法實(shí)現(xiàn)單克隆化，然后運(yùn)用鑒定手段確保不存在其他雜細(xì)胞，即可去除細(xì)胞交叉污染。
