【目錄號(hào)】RAL48TS，RAL48T
【名稱】
通用名稱：內(nèi)毒素檢測(cè)試劑盒（基因重組熒光法）
英文名稱：BioendoTM Recombinant Factor C Endotoxin Test Kit (Fluorescent Assay)
【用途】
用于體外檢測(cè)革蘭氏陰性細(xì)菌內(nèi)毒素。不可用于疾病診斷。
【檢測(cè)原理】
基因重組熒光法采用《中國(guó)藥典》2020年版注射劑安全性檢查法應(yīng)用指 導(dǎo)原則“重組C因子法”檢測(cè)細(xì)菌內(nèi)毒素。使用基因重組技術(shù)，在真核 細(xì)胞表達(dá)鱟血細(xì)胞中與內(nèi)毒素起反應(yīng)的絲氨酸蛋白酶催化級(jí)聯(lián)蛋白。其 中重組C因子與內(nèi)毒素結(jié)合之后，由無(wú)活性的蛋白酶原轉(zhuǎn)變成具有生物 活性的蛋白酶，識(shí)別并催化下游熒光底物產(chǎn)生熒光信號(hào)。熒光信號(hào)的強(qiáng) 度和內(nèi)毒素濃度成正相關(guān)，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)曲線的比較，計(jì)算出樣品中內(nèi)毒 素的濃度。
【儲(chǔ)存條件及有效期】
2-8℃保存，有效期兩年。
【注意事項(xiàng)】
（1） 該試劑盒用于體外細(xì)菌內(nèi)毒素的定量檢測(cè)，嚴(yán)禁用于檢測(cè)臨床樣本內(nèi)毒素或作為診斷人類疾病的輔助工具，嚴(yán)禁試劑以任何途徑進(jìn)入機(jī) 體。
（2） 接觸試劑及供試品的所有器皿必須是無(wú)熱原的，玻璃器皿和材料可以250℃，30分鐘滅菌處理。試驗(yàn)過(guò)程應(yīng)防止微生物的污染。
（3） 該說(shuō)明書(shū)中的無(wú)熱原指內(nèi)毒素濃度小于0.001 EU/ml。
（4）供試品溶液和重組因子試劑混合后溶液的pH值應(yīng)在6.0~8.0之間， 若超出此范圍，需用無(wú)熱原的緩 沖液、0.1N氫氧化鈉或0.1N鹽酸調(diào)節(jié)。
（5）塑料管不建議用于內(nèi)毒素稀釋，稀釋的內(nèi)毒素溶液靜置時(shí)間超過(guò) 10分鐘，用前在旋渦混合器上劇烈振搖1分鐘，放置4小時(shí)以上的內(nèi)毒素 溶液應(yīng)丟棄。
（6） 重組因子試劑必須用配套的檢測(cè)緩沖液溶解；不要用旋渦混合器劇烈振搖；溶解的重組因子試劑應(yīng)在10分鐘內(nèi)使用；若采用多道移液器， 將溶解的重組因子試劑轉(zhuǎn)移到無(wú)熱原加樣槽，并輕輕搖勻。
（7） 檢測(cè)軟件相關(guān)參數(shù)可以根據(jù)《質(zhì)檢報(bào)告》進(jìn)行設(shè)定，也可以根據(jù)實(shí)際情況在范圍內(nèi)進(jìn)行調(diào)整，以給出標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)最佳為宜。
【樣本采集和保存】
樣本采集時(shí)必須小心操作以避免微生物或內(nèi)毒素污染。試驗(yàn)所用的器皿 需經(jīng)處理，以去除可能存在的外源性內(nèi)毒素。耐熱器皿常用干熱滅菌法
（250℃、30分鐘以上）去除，也可采用其他確證不干擾細(xì)菌內(nèi)毒素檢查 的適宜方法。若使用塑料器具，如微孔板和與微量加樣器配套的吸頭 等，應(yīng)選用標(biāo)明無(wú)內(nèi)毒素并且對(duì)試驗(yàn)無(wú)干擾的器具。
樣本應(yīng)儲(chǔ)存于細(xì)菌不會(huì)繁殖或內(nèi)毒素水平不會(huì)改變的條件下。比如，樣 本可以2~8℃臨時(shí)存儲(chǔ)（不到24小時(shí)），或-10℃以下長(zhǎng)期存儲(chǔ)（24小時(shí) 以上）。適當(dāng)?shù)娜萜骱痛鎯?chǔ)條件需用戶自行驗(yàn)證。
【供試品溶液的制備】
某些樣本需進(jìn)行復(fù)溶、稀釋或在水性溶液中浸提制成供試品溶液。必要 時(shí)，可調(diào)節(jié)被測(cè)溶液（或其稀釋液）的pH值，一般供試品溶液和重組因 子試劑混合后溶液的pH值在6.0~8.0的范圍內(nèi)為宜，可使用適宜的酸、 堿溶液 或緩沖液調(diào)節(jié)pH值。酸或堿溶液須用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水在已去
除內(nèi)毒素的容器中配制。緩沖液必須經(jīng)過(guò)驗(yàn)證不含內(nèi)毒素和干擾因子。
【內(nèi)毒素限值的確定】
藥品、生物制品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值（L）一般按以下公式確定：
L= K / M
式中 L為供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值，一般以EU/ml、EU/mg或EU/U（活性單位）表示； K為人每千克體重每小時(shí)最大可接受的內(nèi)毒素劑量，以EU/（kg·h）表 示，注射劑K=5 EU/（ kg·h），放射性藥品注射劑K=2.5 EU/（kg·h）， 鞘內(nèi)用注射劑K=0.2EU/（kg·h）； M為人用每千克體重每小時(shí)的最大供試品劑量，以ml/（kg·h）、mg/（kg·h）或U/（kg·h）表示，人均體重按60kg計(jì)算，人體表面積按 1.62m 計(jì)算。注射時(shí)間若不足1小時(shí)，按1小時(shí)計(jì)算。供試品每平方米體表面積2 劑量乘以0.027即可轉(zhuǎn)換為每千克體重劑量（M）。
按人用劑量計(jì)算限值時(shí)，如遇特殊情況，可根據(jù)生產(chǎn)和臨床用藥實(shí)際情況做必要調(diào)整，但需說(shuō)明理由。
【確定最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）】
最大有效稀釋倍數(shù)數(shù)是指在試驗(yàn)中供試品溶液被允許達(dá)到稀釋的最大倍數(shù)（1→MVD），在不超過(guò)此稀釋倍數(shù)的濃度下進(jìn)行內(nèi)毒素限值的檢 測(cè)。用以下公式來(lái)確定MVD：
MVD = c L /λ
式中 L為供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值；
c為供試品溶液的濃度，當(dāng)L以EU/mg或EU/U表示時(shí)，c的單位需為mg/ml或U/ml，當(dāng)L以EU/ml表示時(shí)，則c等于1.0ml/ml。如需計(jì)算在MVD時(shí)的供試品濃度，即最小有效稀釋濃度，可使用公式c=λ/L； λ為所使用的標(biāo)準(zhǔn)曲線上最低的內(nèi)毒素濃度。
【用法】
1. 試劑與器材
1.1 試劑
重組因子試劑、檢測(cè)緩沖液、細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水。
1.2 器材：
無(wú)熱原試管、無(wú)熱原吸頭、無(wú)熱原96孔微孔板（或可拆式板條）； 旋渦混合器、移液器、試管架；
帶溫育系統(tǒng)的熒光微孔板讀數(shù)儀器及配套軟件。
2. 實(shí)驗(yàn)方法 2.1熒光測(cè)定儀器的程序及模板設(shè)定
以熒光微孔板讀數(shù)儀FLUOROSKAN為例： (1)溫度設(shè)定：孵育溫度37ºC。 (2)振板設(shè)定：中速、振板15秒
(3)讀數(shù)波長(zhǎng)設(shè)定：當(dāng)使用熒光微孔板讀數(shù)儀FLUOROSKAN時(shí)，推薦使用激發(fā)波長(zhǎng)355nm/發(fā)射波長(zhǎng)460nm。讀取反應(yīng)開(kāi)始和30分鐘時(shí)的熒光信號(hào)儀。
2.2 內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液配制
為了計(jì)算未知樣品中內(nèi)毒素濃度，每個(gè)試驗(yàn)必須引用一個(gè)有效的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
用標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素配成溶液，制成至少3個(gè)濃度的稀釋液（相鄰濃度間稀釋倍數(shù)不得大于10），最低濃度不得低于所用重組因子試劑的標(biāo)示檢測(cè)限。
（1）取細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品1瓶，開(kāi)啟后加入適量細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水，置旋渦混合器上劇烈振搖15分鐘，配制濃度為50EU/ml的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液。
（2）取無(wú)熱原試管4支并標(biāo)記，細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水作稀釋液，將50EU/ml的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液依次梯度稀釋，配制為5.0EU/ml、0.5EU
/ml、0.05EU/ml和0.005EU/ml等4個(gè)濃度。各個(gè)濃度內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液配制時(shí)，均應(yīng)在旋渦混勻器上混勻至少1分鐘。內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液的配制可參考下表：
|
內(nèi)毒素濃度
（EU/ml）
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稀釋液體積
（ml）
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加入內(nèi)毒素濃度
（EU/ml）
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加入內(nèi)毒素體積
（ml）
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5.0
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0.9
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50
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0.1
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0.5
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0.9
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5.0
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0.1
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0.05
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0.9
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0.5
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0.1
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0.005
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0.9
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0.05
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0.1
|
上表提出了一種適用于試劑盒的細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品配制系列濃度內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液的方案。并非所有的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液都必須用于生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。可以使用替代稀釋方案，也可以使用其他確定效價(jià)的內(nèi)毒 素。用戶可以根據(jù)具體的產(chǎn)品需求選擇標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍。數(shù)據(jù)表明，特定范圍標(biāo)準(zhǔn)曲線可以提高測(cè)試樣本內(nèi)毒素預(yù)測(cè)值的準(zhǔn)確性。
2.3 重組因子試劑溶解
重組因子試劑是由真核細(xì)胞表達(dá)的重組因子蛋白和熒光基質(zhì)制備的冷凍干燥品。使用前，每瓶重組因子試劑必須按標(biāo)示量用配套的檢測(cè)緩沖 液。如果使用量超過(guò)一瓶，將兩瓶或更多瓶分別復(fù)溶，混合后輕輕搖 勻，靜置至溶液澄清后使用。
2.4 實(shí)驗(yàn)操作
（1）預(yù)熱熒光微孔板讀數(shù)儀FLUOROSKAN，設(shè)置檢測(cè)溫度為 37℃。
（2）取無(wú)熱原黑色微孔板或所需數(shù)量的黑色微孔板條，微孔板條裝至 微孔板架上。相應(yīng)孔中分別加入細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（作為陰性對(duì) 照）、內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液或稀釋液，供試品溶液等各100μl，分別2~3個(gè)重復(fù)。
（3） 微孔板放入預(yù)熱的熒光微孔板讀數(shù)儀FLUOROSKAN中， 37℃孵育至少10分鐘。
（4） ） 取出微孔板， 每孔小心加入50μl重組因子試劑（避免產(chǎn)生氣泡!）。
（5） 將微孔板放入熒光微孔板讀數(shù)儀FLUOROSKAN中（不要蓋上微孔 板蓋！），點(diǎn)擊檢測(cè)軟件界面“確定”按鈕，運(yùn)行檢測(cè)程 序。
（6）檢測(cè)程序結(jié)束后，進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和數(shù)據(jù)分析。
3. 數(shù)據(jù)處理
（1）設(shè)定讀數(shù)之前震蕩15s，隨后靜置孵育3min；讀數(shù)之后，孵育總時(shí)長(zhǎng)30min；
（2）設(shè)定激發(fā)波長(zhǎng)355nm，發(fā)射波長(zhǎng)460nm。
（3）建立標(biāo)準(zhǔn)曲線
Lg（Y）= A* lgB +a，其中：Y為30min中熒光值減去起始的熒光值，B 為內(nèi)毒素的濃度，A為直線斜 率，a為Y軸截距。
（4）使用軟件可以線性回歸自動(dòng)計(jì)算出結(jié)果。
（5） 如果線性相關(guān)系數(shù)|r|≥0.980，則可以建立多項(xiàng)式模型制作標(biāo)準(zhǔn) 曲線，計(jì)算樣品內(nèi)毒素濃度。
（6）當(dāng)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)同時(shí)滿足如下三個(gè)條件時(shí)實(shí)驗(yàn)才有效：
① 標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度點(diǎn)≥3，線性相關(guān)系數(shù)|r|≥0.980；
② 標(biāo)準(zhǔn)曲線最低點(diǎn)的熒光值大于陰性對(duì)照的熒光值；
③ 供試品平行管的平均值在標(biāo)準(zhǔn)曲線的區(qū)間內(nèi)。
【供試品的干擾試驗(yàn)】
1. 以下情況需進(jìn)行供試品的干擾實(shí)驗(yàn)：
（1）當(dāng)對(duì)新藥或無(wú)內(nèi)毒素檢查項(xiàng)的品種建立內(nèi)毒素檢查法時(shí)，必須進(jìn)行干擾試驗(yàn)；
（2）當(dāng)試劑、供試品的來(lái)源、配方、生產(chǎn)工藝改變，或試驗(yàn)環(huán)境中發(fā) 生了任何有可能影響試驗(yàn)結(jié)果的變化時(shí)，必須重新進(jìn)行干擾試驗(yàn)；
（3）當(dāng)供試品中可能存在對(duì)內(nèi)毒素檢測(cè)試驗(yàn)的干擾物質(zhì)時(shí)，須進(jìn)行干擾試驗(yàn)。
2. 干擾實(shí)驗(yàn)：
（1）選擇標(biāo)準(zhǔn)曲線中點(diǎn)或一個(gè)靠近中點(diǎn)的內(nèi)毒素濃度（設(shè)為λm），作為供試品干擾試驗(yàn)中添加的內(nèi)毒素濃度，如采用標(biāo)準(zhǔn)曲線為50，5， 0.5，0.05，0.005EU/ml系列時(shí)，可以用供試品配制0.5EU/ml內(nèi)毒素濃 度作為實(shí)驗(yàn)的供試品陽(yáng)性對(duì)照。
（2）用供試品溶液配制濃度為λm的內(nèi)毒素溶液（即含λm內(nèi)毒素的供
試品陽(yáng)性對(duì)照），測(cè)量出該溶液的內(nèi)毒素濃度，稱為Cs。
（3）測(cè)量出未添加外源內(nèi)毒素的供試品溶液內(nèi)毒素濃度, 稱為C t。
（4）計(jì)算該試驗(yàn)條件下的回收率：R =（Cs –Ct ）/ λm × 100％。
（5）當(dāng)R在50％～200％之間，則認(rèn)為在此試驗(yàn)條件下供試品溶液不存在明顯干擾作用。
（6）當(dāng)R在50％～200％之外，需對(duì)供試品進(jìn)行系列稀釋或進(jìn)行其它處 理消除干擾，每一稀釋溶液都重復(fù)步驟2~4，直到內(nèi)毒素的回收率在50％～200％之間。選擇回收率最接近100％的稀釋倍數(shù)進(jìn)行內(nèi)毒素檢 測(cè)。
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8. 2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》—— 1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法
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